Mae IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactosid) yn analog o swbstrad β-galactosidase, sy'n anwythol iawn.O dan anwythiad IPTG, gall y inducer ffurfio cymhleth gyda'r protein repressor , Fel bod cydffurfiad y protein repressor yn cael ei newid, fel na ellir ei gyfuno â'r genyn targed, a mynegir y genyn targed yn effeithlon.Felly sut y dylid pennu crynodiad IPTG yn ystod yr arbrawf?Ai gorau po fwyaf?
Yn gyntaf, gadewch i ni ddeall egwyddor ymsefydlu IPTG: mae operon lactos (elfen) E. coli yn cynnwys tri genyn adeileddol, Z, Y, ac A, sy'n amgodio β-galactosidase, permease, ac acetyltransferase, yn y drefn honno.mae lacZ yn hydrolysu lactos i mewn i glwcos a galactos, neu i alo-lactos;mae lacY yn caniatáu i lactos yn yr amgylchedd basio trwy'r gellbilen ac yn mynd i mewn i'r gell;Mae lacA yn trosglwyddo'r grŵp asetyl o acetyl-CoA i β-galactosid, sy'n golygu cael gwared ar effaith wenwynig.Yn ogystal, mae yna ddilyniant gweithredu O, dilyniant cychwynol P a genyn rheoleiddiol I. Mae'r cod genyn I yn brotein repressor sy'n gallu rhwymo i sefyllfa O y dilyniant gweithredwr, fel bod yr operon (meta) yn cael ei atal a diffodd.Mae yna hefyd safle rhwymo ar gyfer safle rhwymo protein-CAP ysgogydd genynnau catabolig i fyny'r afon o'r dilyniant cychwyn P. Mae'r dilyniant P, y dilyniant O a'r safle rhwymo PAC gyda'i gilydd yn ffurfio rhanbarth rheoleiddiol y lac operon.Mae genynnau codio'r tri ensym yn cael eu rheoleiddio gan yr un rhanbarth rheoleiddiol i gyflawni mynegiant cydgysylltiedig cynhyrchion genynnau.
Yn absenoldeb lactos, mae'r lac operon (meta) mewn cyflwr o ormes.Ar yr adeg hon, mae'r repressor lac a fynegir gan y dilyniant I o dan reolaeth y dilyniant hyrwyddwr DP yn rhwymo i'r dilyniant O, sy'n atal RNA polymerase rhag rhwymo i'r dilyniant P ac yn atal cychwyn trawsgrifio;pan fo lactos yn bresennol, gellir ysgogi'r lac operon (meta) Yn y system operon (meta) hon, nid lactos ei hun yw'r inducer go iawn.Mae lactos yn mynd i mewn i'r gell ac yn cael ei gataleiddio gan β-galactosidase i'w drawsnewid yn allolactos.Mae'r olaf, fel moleciwl inducer, yn rhwymo i'r protein repressor ac yn newid y cydffurfiad protein, sy'n arwain at ddaduniad y protein repressor o'r dilyniant O a thrawsgrifio.Mae isopropylthiogalactosid (IPTG) yn cael yr un effaith ag allolactos.Mae'n inducer pwerus iawn, nad yw'n cael ei fetaboli gan facteria ac mae'n sefydlog iawn, felly fe'i defnyddir yn eang mewn labordai.
Sut i benderfynu ar y crynodiad gorau posibl o IPTG?Cymerwch E. coli fel enghraifft.
Cafodd y straen E. coli BL21 wedi'i beiriannu'n enetig sy'n cynnwys y pGEX ailgyfunol positif (CGRP/msCT) ei frechu i gyfrwng hylif LB sy'n cynnwys 50μg·ml-1 Amp, a'i feithrin dros nos ar 37°C.Cafodd y diwylliant uchod ei frechu i 10 potel o gyfrwng hylif LB ffres 50mL sy'n cynnwys 50μg·mL-1 Amp ar gymhareb o 1:100 ar gyfer diwylliant ehangu, a phan oedd gwerth OD600 yn 0.6 ~ 0.8, ychwanegwyd IPTG at y crynodiad terfynol.Mae'n 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0mmol·L-1.Ar ôl ymsefydlu ar yr un tymheredd a'r un pryd, cymerwyd 1 mL o'r hydoddiant bacteriol ohono, a chasglwyd y celloedd bacteriol trwy allgyrchu a'u rhoi yn destun SDS-PAGE i ddadansoddi dylanwad gwahanol grynodiadau IPTG ar fynegiant protein, ac yna dewiswch y crynodiad IPTG gyda'r mynegiant protein mwyaf.
Ar ôl arbrofion, canfyddir nad yw crynodiad IPTG mor fawr â phosib.Mae hyn oherwydd bod gan IPTG wenwyndra penodol i facteria.Bydd mynd y tu hwnt i'r crynodiad hefyd yn lladd y gell;a siarad yn gyffredinol, rydym yn gobeithio y bydd y protein mwy hydawdd a fynegir yn y gell, y gorau, ond mewn llawer o achosion pan fydd y crynodiad o IPTG yn rhy uchel, bydd llawer iawn o gynhwysiant yn cael ei ffurfio.Corff, ond gostyngodd faint o brotein hydawdd.Felly, yn aml nid y crynodiad IPTG mwyaf addas yw'r mwyaf, y gorau, ond yr isaf yw'r crynodiad.
Pwrpas sefydlu a thyfu rhywogaethau wedi'u peiriannu'n enetig yw cynyddu cynnyrch y protein targed a lleihau costau.Mae mynegiant y genyn targed nid yn unig yn cael ei effeithio gan ffactorau'r straen ei hun a'r mynegiant plasmid, ond hefyd gan amodau allanol eraill, megis crynodiad yr inducer, y tymheredd sefydlu a'r amser sefydlu.Felly, yn gyffredinol, cyn i brotein anhysbys gael ei fynegi a'i buro, mae'n well astudio'r amser sefydlu, tymheredd a chrynodiad IPTG er mwyn dewis yr amodau priodol a chael y canlyniadau arbrofol gorau.
Amser post: Rhagfyr-31-2021